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Método Western Blotting Para Detecção De Mormo.

Método Western Blotting Para Detecção De Mormo. 1

Western Blotting (WB), também conhecido como Imunoblotting (IB), é uma técnica bem estabelecida e amplamente utilizada para a detecção e análise das proteínas. Essa técnica é baseada na construção de um complexo anticorpo-proteína através da ligação de anticorpos específicos em proteínas imobilizadas sobre uma membrana e a detecção de anticorpo ligado a partir de vários métodos de detecção. O teste detecta animais com clínica inaparente e aqueles infectados em fase crônica.

A técnica de WB preconiza a preparação do antígeno lipopolissacarídeo (LPS) parcialmente purificado a partir de três cepas virulentas de B. mallei. O antígeno é transferido para uma membrana de 0,45μM de nitrocelulose, usando o Novex Blot Module. A membrana é então acondicionada em Blocking solution, e em seguida é lavada e cortada em tiras de 3 mm e armazenadas a -20 ° C. As tiras devem ser colocadas para reagir com soro testado na diluição de 1:50 com solução Low Cross (LC) por 1 hora e 30 minutos, e em seguida deve ser realizada a lavagem com solução Washing buffer, em três vezes de 20 minutos.

Na sequência, as tiras devem ser incubadas durante 1 hora e 30 minutos em conjugado IgG com fosfatase alcalina antihorse (IgG AP antihorse) na diluição de 1:5000 com LC . Realiza-se então outra lavagem com a mesma solução anteriormente citada. Na fase indicadora da reação, utiliza-se o substrato NBT-BCIP, durante 10 minutos ou até surgirem as bandas de lipopolissacarídeos (LPS).

A reação é cessada com água ultrapura. Os resultados quando positivos são bastantes confiáveis devido à detecção dos lipopolissacarídeos por peso molecular de 37 kDa, o negativo não apresentará marcação no strip, e o resultado inconclusivo apresentar-se-a entre o negativo e o positivo, porém não marcado na tira.

Texto por: Daiane Schroeder, Medica Veterinaria CRMV/SC 7303. Rio Negrinho/SC

Edição e Revisão: Deivisson Ferreira Aguiar – Médico Veterinário CRMV/ES 1569 – Muniz Freire/ES

 

REFERÊNCIA

FALCAO, M. V. D.; et al. PADRONIZAÇÃO DE WESTERN BLOTTING PARA DIAGNÓSTICO DO MORMO (Burkholderia mallei) EM EQUÍDEOS. XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro. Disponível em: http://www.eventosufrpe.com.br/2013/cd/resumos/R0016-2.pdf

 

 

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